STEER-seq：基于重组酶的池化多模态单细胞扰动筛选平台

自Perturb-seq将CRISPR扰动条形码与液滴单细胞RNA测序结合以来，池化单细胞扰动筛选已成为功能基因组学的核心手段，可在同一实验中并行读取大量扰动的转录组效应 ^[1]。此后，直接捕获sgRNA让组合扰动变得可行 ^[2]，TAP-seq借助靶向测序把单次实验的扰动规模推到数千 ^[3]，Perturb-ATAC将读出扩展到染色质可及性 ^[4]，压缩设计和体内AAV递送又分别在成本与应用场景上继续拓展 ^[5][6]。不过这一体系基本围绕CRISPR介导的扰动展开；对以过表达转录因子来改写细胞身份的功能获得型筛选，随机病毒整合带来的转基因拷贝数、整合位点与基因组背景差异会干扰扰动间的定量比较，是长期存在的瓶颈。

针对这一问题，研究者提出STEER-seq（Single-cell Transgene Expression via Exchange Recombination sequencing），一个在hiPSC中开展池化ORF功能获得筛选的无病毒平台。其核心是Bxb1介导的不可逆定点整合：无启动子的供体文库被整合到界定的基因组安全港位点，使每个外源基因以单拷贝形式受同一启动子驱动、处于同一基因组环境，并通过条形码在单细胞测序中直接回读扰动身份。在聚焦造血的筛选中，单独表达SPI1即可在无外源细胞因子条件下驱动hiPSC向HSC/MPP样祖细胞分化，且瞬时诱导产生的祖细胞仍保留多系造血分化潜能；联合RNA与染色质可及性测定把转录因子诱导的转录响应与染色质重塑联系起来，重建了扰动诱导的基因调控网络，包括RUNX2驱动的成骨程序。规模扩展到约2000个人类编码序列后，作者系统发现了能诱导不同细胞状态程序的转录因子，涵盖神经祖细胞、黑色素细胞和血管平滑肌样状态，以及维持多能性的因子。

相对已有认识，这项工作的推进在于：此前大规模、多模态的单细胞扰动筛选主要建立在CRISPR框架上——TAP-seq在单次实验中分析数千CRISPR扰动 ^[3]，压缩Perturb-seq以数量级降低的成本覆盖数百基因 ^[5]，Perturb-ATAC同时读取扰动与开放染色质 ^[4]——而STEER-seq把相近量级的多模态读出带入ORF功能获得筛选，并凭借统一的表达与基因组环境使扰动之间可比，为定向工程化人类细胞身份提供了可扩展的定量框架。

局限方面，该平台依赖携带定点整合受体的hiPSC系统，演示限于体外分化情境；能否推广到其他细胞类型乃至体内筛选（如AAV-Perturb-seq所示的应用 ^[6]），以及SPI1诱导的HSC/MPP样祖细胞是否具备真正造血干细胞的体内长期重建能力，摘要中均未交代，仍属待解问题。