Illumina NGS 文库制备：DNA/RNA 建库、靶向富集、磁珠纯化与 QC（Eric Chow）

围绕 Illumina 文库制备，此前的文献大多是在单项环节上做优化：在接头中加入样本特异性条形码，使多个样本可在一次运行中并行测序，目标捕获也因此在很大程度上取代 PCR 成为首选的目标富集方式，且整套流程可在 96 孔板中用多通道移液器完成 ^[1]；但建库中的 PCR 扩增被证明是碱基组成偏差的主要来源，极端 GC 含量的位点常被低估甚至缺失 ^[4]，扩增引入的重复序列与覆盖不均还会给组装和变异分析带来困难 ^[5]；Nextera 转座酶路线则通过小体积反应和平价替代试剂，把建库成本压到每样本约 8 美元 ^[3]。这些知识散落在各自的协议论文里，各解决一个侧面，湿实验人员始终缺少一份把原理、操作与质控串成整体的系统讲解。

这条消息介绍的正是这样一份“操作手册”：UCSF 的 Eric Chow 在 iBiology 实验技术系列中用约 25 分钟讲透 Illumina 建库全流程。DNA 建库分两条路线，TruSeq 依次做末端修复、加 A 尾、连接带 T 尾接头，PCR 可选、材料充足时可做 PCR-free；Nextera 用转座酶一步同时完成打断和加部分接头，但必须 PCR 补全。靶向富集比较了生物素探针杂交加磁珠下拉与多重 PCR 扩增两种策略，只测外显子或特定区段以节省测序成本。RNA 建库强调 Illumina 只能测 DNA，需先经 polyA 捕获或 rRNA 去除富集 mRNA，逆转录成 cDNA 后走 TruSeq 或模板转换的 Smart-seq。接头中插入 i7/i5 双条形码即可多样本混样、测序时按码拆分；磁珠纯化利用 PEG 加盐按核酸长度选择性沉淀，调节 PEG 浓度便能做 size selection。质控部分尤其实用：用 Bioanalyzer 或 TapeStation 看片段分布时，要警惕约 130 bp 的 adapter dimer、低端的引物污染 smear 和过扩增形成的 bubble product 双峰；定量优先 qPCR、数字 PCR 或 Qubit，避免 NanoDrop。

相对已有认识，这个讲座的推进不在于提出新方法，而在于把零散结论整合成连贯的判断框架。比如“材料够就可 PCR-free”的建议，正对应文献中长期存在的取舍——免扩增可减少重复序列与覆盖不均 ^[5]，代价则是需要大量起始 DNA ^[6]；讲座指出必须 PCR 补全的 Nextera 路线，也正是低成本、高通量建库方案所依托的标签化体系 ^[3]。再辅以 QC 图谱如何判读、为何选 qPCR 而非 NanoDrop 的解释，操作者能理解每一步背后的因果，而不是照抄某一份协议。它与同批的单细胞多组学测序技术内容互为补充，共同构成方法学主题。

局限也清楚：这是一堂综述性的方法学讲座，本身不产生新流程或新数据；覆盖的是 TruSeq、Nextera、Smart-seq 等主流路线，对古 DNA 或降解样本所需的单链建库方案 ^[2] 未予讨论，极端 AT 或 GC 偏倚基因组的建库仍需专门优化 ^[6]，这些场景下的具体取舍还得回到各自的协议文献中去解决。