研究构建 Acanthamoeba 线粒体蛋白组 AcMitoCarta 并刻画受氧动态调控的好氧与厌氧通路

线粒体传统上被视为有氧能量工厂，其蛋白组分在哺乳动物中已通过质谱、定位与机器学习整合策略被系统清点，形成广为使用的 MitoCarta 系列资源 ^[2][3][4]。然而真核生物中线粒体形态与代谢差异极大：某些谱系（如 Trichomonas vaginalis）已彻底丢失 mtDNA 与 OXPHOS，依赖厌氧途径产 ATP；Acanthamoeba castellanii 作为阿米巴代表，既是引起角膜炎乃至脑脓肿的机会性病原体 ^[1]，又因基因组富含原核来源水平基因转移 ^[5]，使线粒体功能既具比较生物学价值又难以用常规手段解析。此前 Gawryluk 等的质谱工作虽得到约 1,033 个蛋白的清单，但据作者估算其灵敏度仅约 61%、假阳性率约 25%，且依赖人工校正。

为突破这些瓶颈，本文作者首先利用深度转录组对核基因组重新注释，将基因结构准确率从约 52% 提升至 98%；进而建立"密度纯化+亲和纯化+数据非依赖采集质谱+蛋白相关性谱"（MitoViaPCP）的统一流程，最终得到含 1,084 个蛋白的列表，估计灵敏度约 80%、假阳性率约 8%。结合 96 个经共聚焦显微成像验证的蛋白（含 74/76 个 MitoViaPCP 成员）与 42 个 mtDNA 编码的 ORF，构建了包含 1,122 个蛋白的 AcMitoCarta。与 Gawryluk 列表相比，AcMitoCarta 多出 316 个蛋白、排除了 227 个非线粒体蛋白，灵敏度与特异性均有提升。

以此高质量蛋白组为起点，作者通过蓝 native 电泳质谱系统描绘线粒体"复合体组"，鉴定出 20 种线粒体复合体 ^[6]。多个 OXPHOS 复合体显示区别于人、酵母乃至顶复门原虫 ^[7] 的独特组成：CI 含 13 个新共迁移亚基；CIII 由 PMPCB 取代 UQCRC1 形成基质侧异源四聚体；CV 二聚体（约 2 MDa）通过新发现的 MASA 亚基将线粒体苹果酸脱氢酶二聚体整合进周边 stalk，将 TCA 循环与 OXPHOS 在结构上直接耦联。先前仅由基因组预测、在 A. castellanii 中从未被定位或测活的厌氧产 ATP 通路——[FeFe]-氢酶 HydA 及装配因子 HydE/G、PFOR、ASCT1B——在 AcMitoCarta 中均以高 PCP 得分出现，并随氧浓度动态变化，为该途径提供了蛋白水平的直接证据。53 个线粒体蛋白源自原核水平基因转移 ^[5]，其中 AcHupA 可在体外结合 DNA 并在细胞内与 mtDNA 共定位，被认为是 TFAM 缺失情况下的功能性替代。

尽管 AcMitoCarta 在数量、质量与注释深度上均有明显推进，仍有 381 个蛋白在人和酵母线粒体中无明确同源物，部分为该谱系特异，使得补全通路成员在很大程度上仍需依靠经验性生物化学；水平基因转移持续为该物种引入新型线粒体成分 ^[5]，意味着任何静态清单都需随新基因流而更新，而厌氧通路在包囊形成期、组织缺氧等真实感染微环境中的生理贡献仍有待进一步评估。