从头设计半胱氨酸蛋白酶
De novo design of cysteine proteases
华盛顿大学 David Baker 团队基于 RFD2-MI → ProteinMPNN → AF3 迭代管道从头设计多个具催化活性的半胱氨酸蛋白酶，并通过 X 射线晶体学、LC-MS、FRET 与哺乳动物细胞实验加以验证。
天然半胱氨酸蛋白酶（如木瓜蛋白酶家族）以 Cys–His–Asn 三联体催化肽键水解，其中 Asn 侧链对活性有贡献但并非绝对不可或缺的关键催化残基 [5]。在蛋白酶超家族层面，活性位点几何受到严格约束：亲核残基的反应性 rotamer 决定局部氧阴离子洞可使用的酰胺 NH，并连同质子传递基团一起限定催化的立体化学 [4]。在病毒这一支，正链 RNA 病毒的 3C 样半胱氨酸蛋白酶与胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶共享 β-折叠拓扑和 His–Asp(Glu)–Cys(Ser) 三联体排布，被视为远缘趋同的产物 [1]。
从头设计这类酶，传统路线是先选定催化机理与最小活性位点模型，再在已有蛋白骨架中寻找能容纳该模型的位点，最后优化周围残基的稳定化作用 [3]。该路线受限于天然骨架的多样性与"序列-结构"关系的复杂性。基于深度学习的"家族级幻觉"策略则先大规模生成具备理想口袋形状的新骨架、再为它们设计序列，已在萤光素酶设计上展示了高形状互补的活性位点构型 [2]。本工作将活性位点骨架搭建方法（RFdiffusion2）与 RFD2-MI 框架结合，从头设计利用活化半胱氨酸亲核体的蛋白酶，并以 PDB 9YNL、9YNM、9YOX、9YOY、9YOZ、9YP0 等六个新晶体结构加以实验验证 [6]。
相比在已有蛋白内"嵌入"活性位点的传统策略 [3]，本工作把设计对象从丝氨酸水解酶、金属水解酶拓展至半胱氨酸水解酶，且不依赖天然骨架，而是围绕催化几何反向生成全新拓扑。同行评估指出，这是结构基础酶设计中截至目前取得的最高速率增强之一 [7]。
仍待回答的问题包括：所设计酶的底物谱与选择性边界尚未充分刻画；尽管晶体结构已经解析，催化中间态的具体几何以及在细胞环境下是否引发脱靶蛋白水解，仍有待进一步评估。
- 1.Cysteine proteases of positive strand RNA viruses and chymotrypsin-like serine proteases. A distinct protein superfamily with a common structural fold · FEBS Lett 1989
- 2.De novo design of luciferases using deep learning · Nature 2023
- 3.De novo enzyme design using Rosetta3 · PLoS One 2011
- 4.Intrinsic evolutionary constraints on protease structure, enzyme acylation, and the identity of the catalytic triad · Proc Natl Acad Sci U S A 2013
- 5.Structural and functional roles of asparagine 175 in the cysteine protease papain · J Biol Chem 1995
- 6.Computational design of cysteine proteases · pubmed.ncbi.nlm.nih.gov 2026
- 7.What deep learning can and cannot (yet) do for enzyme ... · sciencedirect.com 2026
原文给出从头设计半胱氨酸蛋白酶的计算管道、生化活性数据与晶体结构，读者可与同刊丝氨酸水解酶、金属水解酶设计工作直接对照。
来源：Nature · nature.com