CAT-Cube DNA纳米立方体实现活细胞内SARS-CoV-2 RNA实时成像与抗病毒药物评估

RNA病毒突变快、复制迅速，与脊椎动物宿主的关联久远且种类繁多^[2]，从埃博拉、登革热到SARS-CoV-2一再构成全球健康威胁。主流的RT-PCR等体外诊断难以实时呈现病毒与宿主的动态互作；量子点单病毒示踪虽以高亮度和出色光稳定性见长^[1]，但按本文所述，这类方法需对病毒颗粒做基因或化学改造，有扰动其天然行为之虞。在DNA一侧，无酶等温的催化发夹组装（CHA）可实现高倍数信号放大^[5]，双FRET分子信标已能在活细胞内检测mRNA^[4]，DNA笼状结构也被证明可自主进入哺乳动物细胞并长时间保持完整^[3]；然而多数DNA探针仍以分散分子形式工作，局部反应效率与成像对比度受限，抗病毒药效评估也依赖qPCR、蚀斑等需裂解或固定的终点法。

本文提出的CAT-Cube将四条发夹（Ha–Hd）锚定在近似紧凑、刚性四螺旋束的DNA立方骨架上：病毒RNA经Hb上的10 nt toehold识别并触发级联链置换，使荧光团与淬灭团分离而点亮，RNA随后被释放而非被消耗，可循环催化。体外靶RNA信号达mock组的3.8倍，末端荧光较双发夹与四发夹游离体系分别高1.6和3.4倍；连续30秒激光照射后仍保留约85%荧光点，游离发夹则减少45%。CAT-Cube可被细胞自主内化，预孵100分钟即形成传感细胞，溶酶体共定位低，24小时细胞存活率高于90%，预孵48小时后感染组荧光仍为对照的2.4倍。在BSL-2水平的SARS-CoV-2 trVLP体系（ORF1a靶区）中，可检出MOI低至0.1的病毒，荧光随感染时间与剂量递增，流式验证一致，而缺失识别发夹的不完整Cube不响应。

药效评价方面，MLN-4760在1 μM使胞内荧光降68.3%；两种S蛋白适体（各100 nM）分别降69.2%和74.5%，无义序列无效。对源于中药的双苄基异喹啉生物碱CEP——此前在2406种已批准药物筛选中被列为最有效化合物——预孵16小时时信号最低（34.2%），48小时回升至74.5%；与病毒预孵使荧光降67.9%，两种加药流程的抑制差为68.1%对48.4%，提示早期结合ACE2是关键；结合分子对接、50 ns动力学模拟（MM/PBSA结合自由能−33.34 kcal/mol）与RNA测序，作者提出CEP同时结合S蛋白与ACE2、且不改变病毒进入通路相关蛋白表达的非基因组界面机制。

相较分散的信标与CHA组分^[4][5]，此工作以刚性骨架的空间限域换来了灵敏度、亮度与信噪比的同步提升，且无需改造病毒颗粒即可在活细胞中实时读出感染过程与药效动态，延续了DNA笼自主进胞、胞内持久的路线^[3]；此前2022年也有用成像与定量分析刻画感染细胞内SARS-CoV-2 RNA产生动力学与多样性的工作^[6]，可互为参照。但需注意，本文证据均出自trVLP替代体系与细胞实验，在真实病毒、动物及临床情境下的表现，以及CEP作用机制的体内验证，材料中尚未见评估，仍是待解问题。