David Bikard 讲座：用 CRISPR 工程化细菌

CRISPR 历史脉络：1987 年首次观察到重复序列，2002 年统一命名为 CRISPR，2005 年通过生物信息学发现间隔序列匹配噬菌体 DNA，2007 年（Danisco 工业界论文）才首次用实验证明其为原核生物适应性免疫系统。

• CRISPR 历史脉络：1987 年首次观察到重复序列，2002 年统一命名为 CRISPR，2005 年通过生物信息学发现间隔序列匹配噬菌体 DNA，2007 年（Danisco 工业界论文）才首次用实验证明其为原核生物适应性免疫系统。
• II 型 CRISPR（化脓链球菌 Cas9）的工作机制：crRNA 与 tracrRNA 形成双链被 Cas9 识别，依赖 PAM（GG 二核苷酸）识别并解旋 DNA，配对成功后构象改变引入双链断裂；该系统可按需改写向导 RNA 序列来重定位切割位点。
• 细菌基因组编辑策略：利用 Cas9 切染色体可杀死细菌的特点，配合寡核苷酸与重组修复（recombineering）在 E. coli 中实现突变富集——自发突变频率约 10⁻⁴，经「杀掉未突变细胞」的选择可接近全部获得目标突变（待验证其通用性）。
• 抗菌新思路：用噬菌体衣壳作为载体（phagemid）递送靶向耐药基因的 CRISPR，选择性清除携带抗生素耐药基因（如卡那霉素耐药）或质粒的细菌，让敏感株借竞争占据生态位，已在小鼠皮肤定植模型中显示可减少耐药菌定植。
• 催化失活型 dCas9 可用于基因沉默：它结合 DNA 但不切割从而阻断转录；实验提出「踢出模型」解释为何通过向导-靶标错配数来微调表达不会额外引入细胞间噪声，而调节蛋白浓度则会。
• 高通量 pooled CRISPR 筛选：构建约 10⁵ 条向导 RNA 文库，诱导 dCas9 后通过测序比较向导在读库中的丰度变化计算每条向导的适应度效应，可用于绘制细菌生理与遗传互作网络。
• 定位：方法（合成生物学/CRISPR）；非 AI。。